Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) adalah teknik pemisahan analitik yang sangat efisien dan paling umum digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan mengukur analit dalam campuran kompleks, terutama untuk senyawa yang tidak volatil dan sensitif terhadap panas.

8.1 Prinsip Operasi Dasar HPLC

HPLC bekerja dengan memompa fase gerak (cair) bertekanan tinggi melalui kolom yang diisi dengan partikel fase diam yang sangat kecil.

• Pemisahan: Analit-analit dalam sampel berinteraksi dengan fase diam dan fase gerak secara berbeda-beda. Analit yang memiliki afinitas lebih kuat terhadap fase diam akan bergerak lebih lambat, sementara yang lebih kuat terhadap fase gerak akan bergerak lebih cepat. Perbedaan kecepatan ini menyebabkan pemisahan.
• Tekanan Tinggi: Diperlukan tekanan tinggi ($\sim100$ hingga $400$ bar) untuk memaksa fase gerak melewati kolom yang padat, menghasilkan pemisahan yang cepat dan efisien.

8.2 Komponen Utama Sistem HPLC

Sistem HPLC terdiri dari beberapa modul yang bekerja secara simultan:

1. Pelarut/Fase Gerak: Berupa campuran pelarut organik (misalnya Metanol, Asetonitril) dan air. Fase gerak harus bebas gelembung dan didesain untuk mencapai pemisahan terbaik.
   • Elusi Isokratik: Komposisi fase gerak (misalnya $50\%$ Metanol : $50\%$ Air) dipertahankan konstan sepanjang analisis.
   • Elusi Gradien: Komposisi fase gerak diubah secara bertahap selama analisis untuk meningkatkan efisiensi pemisahan.
2. Pompa: Berfungsi mengalirkan fase gerak dari reservoir ke kolom pada laju alir yang konstan dan tekanan tinggi.
3. Injektor: Mekanisme untuk memasukkan volume sampel yang sangat kecil ($5$ $\mu\text{L}$ hingga $100$ $\mu\text{L}$) ke dalam aliran fase gerak sebelum masuk ke kolom.
4. Kolom (Fase Diam): Jantung sistem HPLC, tempat pemisahan terjadi. Kolom terbuat dari baja tahan karat yang diisi dengan material fase diam silika atau polimer berpori.
5. Detektor: Mengubah sinyal fisik (misalnya serapan cahaya, fluoresensi) dari analit yang keluar dari kolom menjadi sinyal listrik yang dicatat.
6. Sistem Pengolah Data: Merekam kromatogram (grafik Sinyal vs. Waktu Retensi) dan melakukan perhitungan kuantitatif.

8.3 Mode Pemisahan (Fase Terikat)

Jenis pemisahan HPLC ditentukan oleh sifat Fase Diam dan Fase Gerak:

Mode Pemisahan	Fase Diam (Stationary)	Fase Gerak (Mobile)	Prinsip Pemisahan	Analit Khas
Fase Terbalik (Reversed Phase, RP-HPLC)	Non-polar (C18, C8)	Polar (Air/Metanol)	Interaksi hidrofobik. Analit non-polar menahan diri paling lama.	Obat-obatan, Senyawa Organik.
Fase Normal (Normal Phase, NP-HPLC)	Polar (Silika, Sianida)	Non-polar (Heksan, Kloroform)	Interaksi polar. Analit polar menahan diri paling lama.	Zat Kimia yang sangat non-polar.
Pertukaran Ion (Ion Exchange)	Gugus ionik yang terikat kuat	Larutan buffer dengan konsentrasi ion berbeda	Afinitas elektrostatik ion terlarut terhadap gugus berlawanan muatan pada fase diam.	Asam Amino, Protein, Ion Anorganik.

8.4 Kromatogram dan Kuantifikasi

Hasil akhir analisis HPLC adalah Kromatogram—sebuah plot yang menunjukkan detektor respons (sinyal) sebagai fungsi dari waktu.

• Waktu Retensi ($\mathbf{t_R}$): Waktu yang dibutuhkan analit dari injeksi hingga mencapai detektor. Digunakan untuk identifikasi kualitatif.
• Luas Puncak (Area Peak): Luas di bawah puncak yang proporsional dengan konsentrasi analit. Digunakan untuk analisis kuantitatif melalui kurva kalibrasi (Bab 7).

$$c_{\text{analit}} \propto \text{Luas Puncak}$$

8.5 Keunggulan HPLC

• Sensitivitas Tinggi: Mampu menganalisis analit pada konsentrasi yang sangat rendah (ppm/ppb).
• Non-Destruktif: Analit dapat diambil kembali setelah pemisahan (terutama untuk pemurnian).
• Fleksibilitas: Dapat memisahkan hampir semua jenis senyawa yang larut dalam pelarut (asam amino, vitamin, protein, obat, polutan).