Keunggulan utama NGS dibandingkan metode Sanger (generasi pertama) adalah kemampuannya untuk melakukan sekuensing terhadap jutaan hingga miliaran fragmen DNA secara bersamaan (paralel). Ini secara radikal meningkatkan throughput (jumlah data yang dihasilkan) dan menurunkan biaya per pasangan basa.
Mekanisme Dasar
Proses umum pada hampir semua platform NGS melibatkan langkah-langkah berikut:
- Persiapan Pustaka (Library Preparation):
- DNA genomik dipecah menjadi fragmen-fragmen pendek.
- Adaptor (urutan DNA sintetik) ditambahkan ke ujung setiap fragmen. Adaptor ini berfungsi sebagai titik jangkar untuk menempelkan fragmen ke flow cell dan sebagai primer untuk reaksi amplifikasi.
- Amplifikasi Klonal:
- Setiap fragmen DNA yang telah terikat dengan adaptor diperkuat (digandakan) secara lokal di permukaan padat (flow cell) untuk menciptakan gugusan fragmen yang identik (klon). Ini memastikan sinyal sekuensing cukup kuat untuk dideteksi.
- Sekuensing dan Deteksi Sinyal:
- Reaksi sekuensing dilakukan pada gugusan klonal tersebut secara paralel. Setiap basa yang dimasukkan (A, T, G, C) dideteksi oleh kamera atau sensor melalui emisi cahaya (fluoresen) atau perubahan pH (kimia).
- Karena seluruh fragmen diurutkan pada waktu yang sama, ini menghasilkan miliaran reads (bacaan) data.
- Bioinformatika:
- Reads pendek yang dihasilkan disatukan kembali (dialignment) ke genom referensi untuk merekonstruksi urutan DNA lengkap.
⚙️ Tiga Platform NGS Utama
Saat ini, ada beberapa platform NGS yang berbeda, masing-masing dengan kelebihan dalam hal panjang read, kecepatan, dan biaya:
1. Sekuensing Berbasis Sintesis (Ilumina)
- Prinsip: Ini adalah platform yang paling dominan. Menggunakan nukleotida yang dimodifikasi secara kimia (mengandung fluoresen dan terminator reversibel). Setelah setiap basa ditambahkan dan dideteksi (flash cahaya), terminator dihapus, memungkinkan basa berikutnya ditambahkan.
- Kelebihan: Akurasi Tinggi dan throughput masif.
- Kekurangan: Panjang read relatif pendek (biasanya 150-300 bp).
2. Sekuensing Semikonduktor (Ion Torrent)
- Prinsip: Menggunakan pendeteksian perubahan pH. Ketika nukleotida dimasukkan, pelepasan ion hidrogen mengubah pH larutan. Sensor semikonduktor mendeteksi perubahan tegangan yang dihasilkan oleh ion $\text{H}^+$.
- Kelebihan: Cepat dan relatif lebih murah. Tidak menggunakan laser atau kamera yang kompleks.
- Kekurangan: Kurang akurat dalam mengurutkan homopolimer (rantai basa yang sama berulang-ulang, misalnya AAAAAA).
3. Sekuensing Generasi Ketiga (Single-Molecule Sequencing)
Platform terbaru yang menghindari langkah amplifikasi klonal dan mengurutkan DNA satu molekul tunggal secara real-time.
- Pacific Biosciences (PacBio) dan Oxford Nanopore Technologies (ONT):
- Prinsip: DNA dilewatkan melalui lubang nano (nanopore). Perubahan arus listrik yang melalui nanopore dideteksi saat basa-basa yang berbeda lewat.
- Kelebihan: Panjang read sangat panjang (bisa puluhan hingga ratusan ribu basa). Ini sangat penting untuk merakit genom yang kompleks dan melewati urutan berulang.
- Kekurangan: Akurasi lebih rendah dibandingkan Ilumina, meskipun terus meningkat.
📊 Aplikasi Utama NGS dalam Penelitian dan Klinis
| Aplikasi | Deskripsi dan Tujuan |
| Genomik (WGS/WES) | WGS (Whole-Genome Sequencing): Mengurutkan seluruh genom untuk mengidentifikasi semua varian. WES (Whole-Exome Sequencing): Mengurutkan hanya bagian pengkode protein (ekson) yang mencakup 1-2% genom, lebih efisien untuk mencari penyebab penyakit genetik. |
| Transcriptomics (RNA-Seq) | Mengukur dan mengkuantifikasi semua molekul RNA dalam sel. Memberikan pemahaman gen mana yang aktif dan pada tingkat apa. Penting untuk studi kanker dan perkembangan sel. |
| Epigenomik (ChIP-Seq) | Digunakan untuk mengidentifikasi lokasi ikatan protein pengatur DNA (faktor transkripsi) atau modifikasi histon pada genom. Memahami regulasi gen. |
| Metagenomik | Mengurutkan semua DNA dalam sampel lingkungan atau klinis (misalnya, mikrobioma usus) untuk mengidentifikasi spesies yang ada dan potensi fungsi genetiknya. |
🛑 Keterbatasan Utama NGS
Meskipun kuat, NGS memiliki keterbatasan:
- Analisis Data (Bioinformatika): Data mentah NGS tidak dapat digunakan tanpa analisis komputasi yang rumit. Kualitas hasil sangat bergantung pada algoritma perataan (alignment) dan pemanggilan varian (variant calling).
- Kesulitan Mapping Daerah Berulang: Reads pendek sulit untuk dipetakan secara unik ke daerah genom yang sangat berulang (misalnya, sentromer atau telomer), menyebabkan celah (gap) dalam perakitan genom.
- Biaya Operasional: Meskipun biaya per basa turun, menjalankan sekuenser NGS masih membutuhkan reagen dan infrastruktur laboratorium yang mahal.
Leave a Reply